Como fazer análise espectrofotométrica: 13 etapas (com fotos)

A espectrofotometria é uma técnica experimental que é usada para medir a concentração de solutos em uma solução específica, calculando a quantidade de luz absorvida por essas soluções. Esta técnica é poderosa porque certos compostos absorverão diferentes comprimentos de onda de luz em diferentes intensidades. Ao analisar a luz que passa pela solução, você pode identificar substâncias dissolvidas específicas em solução e como concentrar essas substâncias. Um espectrofotômetro é o dispositivo usado para analisar soluções em uma configuração de pesquisa de laboratório.

Passos

Parte 1 de 3:

Preparando as amostras

1. Ligue o espectrofotômetro. A maioria dos espectrofotómetros precisa aquecer antes que possam dar uma leitura precisa. Ligue a máquina e deixe-o sentar por pelo menos 15 minutos antes de executar qualquer amostras.

Use o tempo de aquecimento para preparar suas amostras.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 2

2. Limpe as cubetas ou tubos de ensaio. Se você estiver fazendo um laboratório para a escola, você pode estar usando tubos de teste descartáveis que não precisam ser limpos. Se você estiver usando cuvetas ou tubos de teste reutilizáveis, certifique-se de que eles estejam devidamente limpos antes de usar. Enxaguar cada cuvete completamente com água desionizada.

Tome cuidado com cuvetas como eles podem ser bastante caros, particularmente se eles são feitos de vidro ou quartzo. Cuvetes de quartzo são projetadas para uso em espectrofotometria visível UV.

Ao manusear a cuvete, evite tocar nos lados A luz passará (geralmente, os lados claros do contêiner). Se você acidentalmente tocar nesses lados, limpe a cuvete com um kimwipe (que são formulados para evitar arranhar o vidro).

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 3

3. Carregue o volume adequado da amostra na cuvete. Algumas cubetas têm um volume máximo de 1 mililitro (ml) enquanto os tubos de ensaio podem ter um volume máximo de 5 ml. Enquanto o laser produzindo a luz está passando pelo líquido e não uma parte vazia do recipiente, você receberá uma leitura precisa.

Se você estiver usando uma pipeta para carregar suas amostras, use uma nova dica para cada amostra para evitar contaminação cruzada.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Passo 4

4. Prepare uma solução de controle. Conhecido como um espaço em branco, a solução de controle tem apenas o solvente químico em que o soluto a ser analisado é dissolvido em. Por exemplo, se você tivesse sal dissolvido na água, seu espaço em branco seria apenas água. Se você tingir a água vermelha, o espaço em branco também deve conter água vermelha. O espaço em branco é o mesmo volume que a solução a ser analisada e mantida no mesmo tipo de recipiente.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Passo 5

5. Limpe o exterior da cuvete. Antes de colocar a cuvete para o espectrofotômetro que você deseja ter certeza de que está tão limpo quanto possível para evitar a interferência de partículas de sujeira ou poeira. Usando um pano sem fiapos, remova qualquer gotículas de água ou poeira que possa estar do lado de fora da cuvete.

Parte 2 de 3:

Executando o experimento

1. Escolha e defina o comprimento de onda da luz para analisar a amostra com. Use um único comprimento de onda de luz (cor monocromática) para tornar o teste mais eficaz. A cor da luz escolhida deve ser conhecida por ser absorvida por um dos produtos químicos considerados no soluto de teste. Defina o comprimento de onda desejado de acordo com as especificações do seu espectrofotômetro.

Em um laboratório de sala de aula, o comprimento de onda provavelmente será dado a você.
Como a amostra refletirá toda a luz da mesma cor que aparece, o comprimento de onda experimental será sempre uma cor diferente do da amostra.
Objetos aparecem como certas cores porque refletem a luz de comprimentos de onda particular e absorver todas as outras cores. Grama é verde porque a clorofila reflete luz verde e absorve todo o resto.

Imagem intitulada do Spectrophotometric Analysis Step 7

2. Calibre a máquina com o espaço em branco. Coloque o espaço em branco no suporte da cuvete e feche a tampa. Em um espectrofotômetro analógico, haverá uma tela com uma agulha que se move com base na intensidade da detecção de luz. Quando o espaço em branco está, você deve ver a agulha para a direita. Registre este valor caso você precise para mais tarde. Com o espaço em branco ainda na máquina, mova a agulha para zero usando o botão de ajuste.

Especrofotômetros digitais podem ser calibrados da mesma maneira, eles apenas terão uma leitura digital. Defina o espaço em branco para 0 usando os botões de ajuste.

Quando você remove o espaço em branco, a calibração ainda estará no lugar. Ao medir o resto de suas amostras, a absorvância do espaço em branco será automaticamente subtraída.

Certifique-se de usar um único espaço em branco por sessão para que cada amostra seja calibrada para o mesmo espaço em branco. Por exemplo, se você abranger o espectrofotômetro, analise apenas algumas amostras e em branco novamente, as amostras restantes seriam imprecisas. Você precisaria começar de novo.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 8

3. Remova o espaço em branco e teste a calibração. Com o espaço em branco removido a agulha deve ficar em 0 (zero) ou a leitura digital deve continuar a ler 0. Coloque o espaço em branco para a máquina e certifique-se de que a agulha ou a leitura não mude. Se a máquina estiver corretamente calibrada com o seu espaço em branco, tudo deve ficar em 0.

Se a agulha ou a leitura não for 0, repita as etapas de calibração com o espaço em branco.

Se você continuar a ter problemas, busque assistência ou tenha a máquina analisada para manutenção.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 9

4. Medir a absorvância da sua amostra experimental. Remova o espaço em branco e coloque a amostra experimental para a máquina. Deslize a cuvete para a ranhura designada e garantir que ela esteja na posição vertical. Aguarde cerca de 10 segundos até que a agulha esteja estável ou até que os números digitais parem de mudar. Registre os valores de% transmitenciamento e / ou absorvância.

A absorvância também é conhecida como a densidade óptica (OD).

Quanto mais luz é transmitida, menos luz a amostra absorve. Geralmente, você quer gravar os valores de absorvância que geralmente serão dados como decimais, por exemplo, 0.43.

Se você tiver um resultado periférico (como 0.900 quando o resto é por volta de 0.400), dilua a amostra e medir a absorvância novamente.

Repita a leitura para cada amostra individual pelo menos 3 vezes e média juntas. Isso garante uma leitura mais precisa.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 10

5. Repita o teste com comprimentos de onda sucessivos da luz. Sua amostra pode ter vários compostos desconhecidos que variam em sua absorbância, dependendo do comprimento de onda. Para eliminar a incerteza, repita suas leituras em intervalos de 25 nm através do espectro. Isso permitirá que você detecte outros produtos químicos suspeitos de estar no soluto.

Parte 3 de 3:

Analisando os dados de absorvância

1. Calcule a transmitância e a absorvância da amostra. A transmitância é quanto da luz que passou pela amostra atingiu o espectrofotômetro. A absorvância é quanto da luz foi absorvida por um dos produtos químicos no soluto. Muitos espectrofotômetros modernos têm uma saída de transmitância e absorvância, mas se você gravou intensidade, você pode calcular esses valores.

A transmitância (t) é encontrada dividindo a intensidade da luz que passou pela solução de amostra com a quantidade que passou pelo espaço em branco. É normalmente expresso como um decimal ou porcentagem. T = i / i₀ onde eu é a intensidade da amostra e eu₀ é a intensidade do espaço em branco.
A absorvância (a) é expressa como negativa do logaritmo base-10 (exponente) do valor de transmissão: a = -log₁₀T. Por um valor t de 0.1, o valor de A é 1 (0.1 é 10 para o poder -1), o que significa que 10% da luz é transmitida e 90% é absorvida. Por um valor t de 0.01, o valor de A é 2 (0.01 é 10 para o poder -2), o que significa que 1% da luz é transmitida.

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2. Plotar os valores de absorvância versus os comprimentos de onda em um gráfico. O valor da absorvância é plotado no eixo Y vertical contra o comprimento de onda de luz usado para um determinado teste plotado no eixo X horizontal. Plotando os valores máximos de absorbância para cada comprimento de onda do teste de luz, produz o espectro de absorvância da amostra e identifica os compostos que compõem a substância de teste e suas proporções.

Um espectro de absorvância geralmente tem picos em certos comprimentos de onda que podem permitir identificar compostos específicos.

Imagem intitulada de análise espectrofotométrica Etapa 13

3. Compare sua plotagem de espectro de absorvância a parcelas conhecidas de compostos específicos. Os compostos têm espectro de absorvância exclusivo e sempre produzirão um pico no mesmo comprimento de onda toda vez que são medidos. Ao comparar suas parcelas de compostos desconhecidos para aqueles de compostos conhecidos, você pode identificar os solutos que compõem sua solução.

Você também pode usar este método para identificar contaminantes em sua amostra. Se você está esperando 1 pico claro em um comprimento de onda específico e obter 2 picos em comprimentos de onda separados, você sabe que algo não está certo em sua amostra.